Microscopio de campo oscuro. Definición. Cómo utilizarlo

En este artículo vamos a considerar los siguientes puntos:

• Cómo funciona el microscopio de campo oscuro.
• Qué se puede observar con este tipo de microscopios.
• Fundamentos de la microscopía con aceite de inmersión
• Fundamentos de la iluminación en microscopía de campo oscuro
• Microscopio de campo oscuro con alto poder de aumentos
• Aplicación al campo de la biología, la medicina y la educación para la salud.
• Definición de la microscopía en campo oscuro (darkfield blood).

Cómo funciona el microscopio de campo oscuro 

Debido al ángulo de incidencia del haz luminoso sobre el espécimen que se va a observar, el micrcoscopio de campo oscuro permite que el fondo sea oscuro y los bordes del espécimen aparezca brillante. Esto es posible gracias al tipo de condensador que lleva este tipo de microscopio. La luz se dispersa al chocar contra la célula o muestra que se va a observar. Es como si en una habitación oscura entra un pequeño haz de luz por una rendija de una ventana y en el fondo oscuro de la habitación se iluminan las partículas de polvo que flotan en el aire. Lo que en un principio era invisible se vuelve visible.

Para comprender como funciona la microscopía en campo oscuro hemos puesto cuatro videos  y unas cuantas fotografías de nuestro curso de microscopía en campo oscuro que nos enseñan cómo se visualiza la sangre con este tipo de técnica. A continuación se da una explicación muy detallada de cómo funciona la iluminación en un microscopio, así como el diseño, condensadores y ajustes para el uso del microscopio de campo oscuro.

Qué se puede observar con este tipo de microscopios

• Diminutos organismos acuáticos vivos, diatomeas, pequeños insectos, huesos, fibras, cabellos, bacterias teñidas, levaduras, células sanguíneas y protozoos.
• Entre las muestras no biológicas se incluyen: los minerales y cristales químicos, coloides, las muestras de polvo y las secciones delgadas de polímeros y materiales cerámicos que contienen pequeñas inclusiones o diferencias de porosidad. 

Aplicándolo a una muestra de sangre en vivo:

• Las células sanguíneas habituales (eritrocitos, leucocitos y trombocitos) en estado saludable o patológico.
• Residuos metabólicos (ácido úrico, colesterol, placas tóxicas digestivas, placas tóxicas ácidas, simplastos, etc.)
• Agregaciones plaquetarias.
• Partículas dispersas en un medio homogéneo.
• La observación del movimiento Browniano de las partículas.
• Microorganismos con diámetros superior a 0.2 um. 
• Fibrina
• Parásitos simbiontes en fases primitivas, parásitos simbiontes en fases bacterianas patógenas.
• Bacterias.
• Hongos.
• Evolución de las células sanguíneas con el paso del tiempo.
• Se puede utilizar para la observación de preparaciones vivas, sin colorear.
• Visualiza los bordes destacados de las muestras.

Comprar Curso de Campo Oscuro

                Globulos rojos y colonias de tecitos coloides 1 hora desde la extracción

Eritrocitos con linfocito T, tecitos coloides, formas bacteriales, cristal del metabolismo y esporoides con microscopio de campo oscuro

        Eritrocitos con leucocito y fibrina con microscopio de campo oscuro

                    Leucocitos rodeando pseudocristales tóxicos

                                      Eritrocitos con esporoides

                              Sistatogenia: Eritrocitos cuadrados

Fundamentos de la microscopía con aceite de inmersión

La capacidad del objetivo de un microscopio para capturar los rayos de luz provenientes de una muestra depende de la apertura numérica y del medio por el cual pasa la luz.

La apertura numérica de un objetivo es directamente proporcional al índice de refracción del medio existente entre el cristal cubreobjetos de la preparación y la lente frontal del objetivo, y también al seno del semiángulo de la lente del objetivo. Puesto que el seno no puede superar 90 grados, la apertura numérica máxima dependerá del índice de refracción del medio de inmersión.

En la mayoría de microscopios, el medio a través del cual pasan los rayos de luz entre el cristal cubreobjetos y la lente frontal del objetivo, es el aire. Este tipo de objetivos se denominan objetivos en seco porque no utilizan ningún líquido de inmersión. El índice de refracción del aire es 1.0003, muy cercano al del vacío, y es más bajo que el de la mayoría de líquidos, incluido el agua (n = 1.33), glicerina (n = 1.470) y la mayoría de aceites de inmersión para microscopía (aproximadamente, n = 1.515). En la práctica, la apertura numérica máxima de un objetivo en seco se limita a 0.95, y es posible obtener valores superiores utilizando solamente ópticas de inmersión.

Los objetivos diseñados para ser utilizados con aceite de inmersión poseen un mayor número de ventajas respecto a los utilizados en seco. Los objetivos de inmersión normalmente tienen un factor de corrección superior (fluorita o apocromáticos) y pueden tener aperturas numéricas de hasta 1.40 cuando se utilizan con aceites de inmersión con la adecuada dispersión y viscosidad. Estos objetivos permiten una mayor apertura del diafragma para conseguir ampliar la iluminación de la muestra y aprovechar las ventajas de una mayor apertura numérica.

Un factor que normalmente suele despreciarse cuando se utilizan objetivos de inmersión con incremento de la apertura numérica son las limitaciones que aporta el condensador al sistema. Cuando se utiliza un objetivo de inmersión con una apertura numérica AN = 1.40 con un condensador que posee una apertura numérica más baja (por ejemplo, 1.0), la apertura numérica total del sistema se limita a 1.0, la del condensador.

Los condensadores modernos normalmente tienen un alto factor de corrección con un valor de la apertura numérica que varía de 1.0 a 1.40. Para poder aprovechar eficazmente todas las ventajas de la técnica de inmersión, también se debería colocar aceite de inmersión en el punto de intersección entre la lente de condensación y la zona de la preparación que contiene la muestra. 

Este sistema se ha denominado Sistema de Inmersión Homogéneo y es el ideal para conseguir la máxima apertura numérica y resolución de un microscopio óptico. En este caso, el índice de refracción y de dispersión de las lentes de los objetivos, del aceite de inmersión, de la lente del condensador, y el medio de unión entre el cubreobjetos y portaobjetos son iguales o muy parecidos.

En este sistema ideal, un rayo de luz oblicuo puede pasar a través de las lentes del condensador y atravesar completamente la preparación, aceite de inmersión, y medio de unión de la preparación sin que se produzca una refracción durante el paso aceite-cristal o en los puntos de intersección entre el medio donde se sitúa la muestra y los cristales cubreobjetos y portaobjetos.

En ocasiones, cuando se utilizan objetivos acromáticos de inmersión con un alto poder de aumentos es posible evitar colocar aceite en la lente superior del condensador. Esto se produce porque la apertura del diafragma del condensador con frecuencia debe reducirse con objetivos de corrección para eliminar los defectos y mejorar la calidad de las imágenes.

Sangre en descomposición después de cuatro días de la extracción

Fundamentos de la iluminación en microscopía de campo oscuro

La microscopía de campo oscuro es una técnica de iluminación que aprovecha la iluminación oblicua para mejorar el contraste de las muestras que no se visualizan correctamente con las técnicas de iluminación en campo claro. De noche, es posible observar las estrellas a pesar de la enorme distancia. Todo esto se produce por el fuerte contraste entre la luz tenue y el cielo negro. En la microscopia de campo oscuro se aplica este principio. Es un método sencillo y común que convierte en visibles los objetos no coloreados. Estos objetos suelen tener índices de refracción muy próximos a los que los rodean y son difíciles de observar con microscopios de campo claro. Por ejemplo, muchos diminutos organismos acuáticos poseen un índice de refracción que varía de 1.2 a 1.4, lo que significa una diferencia óptica insignificante respecto a los medios acuosos adyacentes. Estos son los objetos ideales para la iluminación en campo oscuro.

La técnica de campo oscuro requiere el bloqueo de la luz central, que normalmente atraviesa y rodea la muestra, permitiendo que, solamente los rayos oblicuos de cada acimut “golpeen” la muestra.

La lente superior de un condensador Abbe para campo oscuro es cóncava, lo que permite a los rayos de luz formar un cono hueco de luz invertida con un vértice centrado en la muestra. Si no hay ninguna muestra y la apertura numérica del condensador es mayor que la del objetivo, todos los rayos que salen del condensador se perderán debido a su oblicuidad y el campo de observación será oscuro.

El sistema condensador/objetivo para campo oscuro representa la configuración más sofisticada de la microscopía de campo oscuro.El objetivo puede contener un diafragma iris interno que sirve para reducir la apertura numérica del objetivo respecto a la del cono de luz emitida por el condensador. El condensador cardioide es un sistema de campo oscuro basado en espejos internos que proyectan un cono de luz hacia la muestra sin generar aberraciones.

Cuando se coloca una muestra concretamente, una no coloreada, en la platina portapreparados, los rayos oblicuos que atraviesan la muestra son reflejados, y/o refractados por las discontinuidades ópticas (como la membrana de la célula, el núcleo y orgánulos internos) permitiendo a los rayos débiles entrar en el objetivo. La muestra puede verse clara sobre un fondo negro. En términos de óptica de Fourier, la iluminación en campo oscuro elimina el factor cero (luz dispersa) a partir del modelo de difracción formado en el plano focal posterior del objetivo. El resultado es una imagen formada exclusivamente a partir de la alta intensidad de difracción dispersada por la muestra.

Los organismos ideales para la observación en campo oscuro son los diminutos organismos acuáticos vivos, diatomeas, pequeños insectos, huesos, fibras, cabellos, bacterias teñidas, levaduras, células sanguíneas y protozoos. Y entre las muestras no biológicas se incluyen los minerales y cristales químicos, coloides, las muestras de polvo y las secciones delgadas de polímeros y materiales cerámicos que contienen pequeñas inclusiones o diferencias de porosidad. Se debe tener cuidado durante la preparación de muestras para microscopía en campo oscuro, porque todo lo que esté por encima y por debajo del plano de enfoque puede dispersar la luz y contribuir a la degradación de la imagen.

El espesor de la muestra y el espesor de la preparación son muy importantes. Normalmente una muestra fina elimina la posibilidad de difracción que puede interferir en la formación de la imagen.

Leucocito (monocito) en descomposición en condritos después de 24 horas de la extracción

Microscopio de campo oscuro con alto poder de aumentos

Si se desea obtener mayor precisión y un fondo más oscuro, se debe elegir un condensador especialmente diseñado para campo oscuro, es decir, que transmita sólo rayos oblicuos.

Hay diversas variedades: condensadores “en seco” para campo oscuro con aire entre la parte superior del condensador y la parte inferior de la preparación y condensadores de inmersión para campo oscuro que requieren el uso de aceite de inmersión (algunos están diseñados para ser usados con agua) para establecer una unión entre la parte superior del condensador y la parte inferior de la preparación.

El condensador de inmersión para campo oscuro posee una superficie interna de espejos con una gran oblicuidad sin aberraciones acromáticas lo que permite obtener los mejores resultados y el mejor sistema en campo oscuro.

Tal vez el condensador para campo oscuro más utilizado es el paraboloide, que consiste en una pieza sólida de vidrio esmerilado muy precisa con forma paraboloide.

Como se ha mencionado anteriormente, el condensador en seco para campo oscuro se utiliza con objetivos cuya apertura numérica es menor que 0.75, mientras que los condensadores de inmersión paraboloides y cardioides se utilizan con objetivos con apertura numérica muy alta (hasta 1.4). Los objetivos con una apertura numérica mayor que 1.2 necesitarán una reducción de su apertura de manera que su apertura numérica máxima no exceda de la apertura numérica del condensador. De esta manera se permite que la luz directa pueda entrar en el objetivo.

Por esta razón, muchos objetivos con una elevada apertura numérica diseñados para ser utilizados con una iluminación en campo oscuro y en campo claro tienen incorporado un diafragma iris regulable que actúa como limitador de la luz.

Esta reducción de la apertura numérica limita también el poder de resolución del objetivo y la intensidad de la luz de la imagen. Los objetivos diseñados exclusivamente para trabajar en campo oscuro se producen con una apertura numérica máxima cercana al límite inferior de la apertura numérica del condensador para campo oscuro. Estos no poseen diafragmas iris internos, sin embargo, los diámetros de sus lentes están ajustados de manera que, al menos una lente interna tenga el diámetro adecuado para funcionar como limitador de la apertura.

El condensador cardiode es muy sensible a la alineación y se debe colocar cuidadosamente para aprovechar el cono de luz. Por esto, resulta el  condensador de campo oscuro más difícil de utilizar.

Además, el condensador produce una importante cantidad de reflejos, incluso con las partículas de polvo más pequeñas, y una distancia focal pequeña puede perjudicar la iluminación de los objetos que poseen un tamaño o espesor de unos pocos micrones. Cuando se trabaja con preparaciones para microscopía de campo oscuro con alto poder de aumentos, asegurarse que el cristal de las preparaciones esté exento de impurezas fluorescentes.

Prestar mucha atención a la lubricación entre la lente de un condensador con una elevada apertura numérica y la parte inferior de la preparación. Es muy difícil evitar la introducción de pequeñas burbujas de aire en la citada zona y por lo tanto, esta técnica debe practicarse de forma minuciosa y perfecta. Las burbujas de aire provocarán una imagen distorsionada y con brillos, dando lugar a una pérdida de contraste y a la disminución de la calidad de la imagen.

También pueden producirse problemas cuando se utilizan cristales cubreobjetos demasiado gruesos o demasiado finos. Muchos condensadores para campo oscuro incluyen en su montura el espesor de la preparación que se debe utilizar. Si el espesor de la preparación es demasiado grueso, es muy difícil enfocarla sin tener que recurrir a un aceite de inmersión de alta viscosidad.

Por otro lado, cuando las preparaciones son demasiado finas tiende a romperse la unión de aceite entre el condensador y la preparación. Por lo tanto, se aconseja adquirir preparaciones microscópicas con el espesor correcto para evitar cualquiera de los problemas mencionados anteriormente.

Los condensadores con una alta apertura numérica utilizados en seco o con aceite de inmersión, deben centrarse de forma muy precisa para lograr un óptimo funcionamiento.

Para conseguirlo, muchos condensadores para campo oscuro poseen un pequeño círculo grabado en la superficie superior para ayudar a centrar el condensador. El centrado se realiza con un objetivo con bajo poder de aumentos (10x-20x) y utilizando los tornillos de centrado del condensador para garantizar que el círculo (y el condensador) estén centrados correctamente en el recorrido óptico. 

Su aplicación al campo de la biología, la medicina y la educación para la salud

Por supuesto esta técnica se utiliza en diferentes campos científicos. Sin embargo, fue el Prof. Dr. Günther Enderlein quien con su investigación sobre las células y el plasma sanguíneo le ha dado popularidad en el campo de la medicina biológica sobre todo en Europa y más específicamente en Alemania.

Es en este país donde se han publicado los principales libros que nos hablan de esta técnica enfatizando o encaminadas a las directrices que dejó Enderlein y el Pleomorfismo.

Algunos de estos son: “Ciclogenia de las bacterias” (Bacteria Cyclogeny) de Günther Enderlein.

De sus más fervientes defensoras tenemos a María M. Bleker que ha publicado: “Examen de sangre en campo oscuro” (Blutuntersuchung im Dunkelfeld) y el más reciente publicado en 2004 “El amigo anónimo o ¿el enemigo desconocido?” (Der verkannte Freund oder der unbekannte Feind).

Otro libro es “Introducción a los Diagnósticos en Campo Oscuro” (Einführung in die Dunkelfelddiagnostik) de, Cornelia Schwerdtle y Franz Arnoul..

Todo esto ha sido el resultado de la lucha por defender posiciones irreconciliables entre si como ha sido el Monomorfismo y el Polimorfismo.

De modo que desde el principio del siglo pasado hasta ahora se ha utilizado para estudiar las células sanguíneas así como el plasma en vivo y sin tinciones.

Se extrae una gota de sangre de un dedo (ya hablaremos de cómo hacer este tipo extracción) y se coloca sobre un cubreobjetos. Después se extiende sobre el portaobjetos. Se coloca aceite de inmersión sobre el condensador del microscopio de campo oscuro y después la muestra sobre la platina del microscopio. A continuación se sube el condensador hasta que haga contacto con el porta y se disperse el aceite sobre la muestra por debajo del cristal. Después se empieza a enfocar con el objetivo de menor aumento y ahí está la sangre en campo oscuro. Hasta unos 400 aumentos podemos verlo sin utilizar más aceite. Sin embargo, para poder observar toda la información que la sangre nos pueda dar hay que utilizar el objetivo de 100X. Para ello, se vuelve a echar una gota de aceite de inmersión encima del cubreobjetos y se coloca el objetivo de 100X sobre la muestra hasta que haga el contacto justo para poder ver las células y coloides sanguíneos en todo su esplendor.

Las dos fases de contacto con la muestra y el ajuste del condensador cardiode con sus tornillos es lo más delicado para tener una excelente visión. 

Definición de la microscopía de Campo Oscuro aplicada a la salud 

Podríamos definir la Microscopia sanguínea en Campo oscuro como la técnica que estudia en vivo, sin tinciones ni sustancias añadidas la sangre humana para comprender mejor la salud del individuo: carencias y excesos relacionados con la alimentación, anemias, vitaminas, residuos tóxicos, predisposiciones patológicas y, sobre todo, endobiosis según el Pleomorfismo.

Gracias a esta técnica biológica podemos observar el terreno del paciente, conociendo mejor las posibles causas de sus enfermedades. Nos permite hacer un mejor seguimiento de la evolución de sus procesos orgánicos, así como de la efectividad del tratamiento natural. Es un método muy eficaz y además muy educativo, ya que si disponemos de una buena pantalla de ordenador, la visualización de la sangre de uno mismo y ver la actividad de los glóbulos rojos, blancos, plaquetas, residuos órganicos y parásitos, nos hace tener mejor conciencia de la necesidad de efectuar cambios en nuestro estilo de vida.

Las fotografías y el video superior, realizado por nosotros, son una pequeña muestra de lo mucho que se puede observar y enseñar a las personas sobre su salud.